オープンフィールドと新奇物体テスト

キャリブレーションの前にカメラ（3Dなら2台）を接続します。そうしなかった場合は、接続してからソフトウェアを再起動します。'Calibrate'をクリックし、'Open Field or Zone Analysis'を選びます。領域が画面の高さか幅をほぼ埋めるようにカメラを置きます。トラッキング領域はアリーナの床です。仕切られたアリーナや複数のアリーナでは、すべてのアリーナを含む床全体、48ウェルや96ウェルではウェルの並び全体（左上のウェルの左上の角から右下のウェルの右下まで）です。ユーザー名を入力し、続いてトラッキング領域全体の高さ（画面の上から下）と幅を入力します。被験体が明るく背景が暗い場合はblackのボックスにチェックを入れ、明るい背景の上の暗い色やフード模様の動物ならチェックを外したままにします。左上と右下の角をクリックし、'Save (and return)'をクリックします。

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必ず左上を先に、右下を2番目にクリックします。下の角を先にクリックすると、キャリブレーションファイルで南北が逆になります。3Dモードでは、トラッキングする垂直の高さも入力し、側面の画像（上の画像）と床（下の画像）の両方の角をクリックします。2Dでは高さの欄を無視するか0を入力します。箱をグリッド状に並べている場合は、左上の箱の左上と右下の箱の右下をクリックします。'Click to calibrate with X-Y recorded video'が必要なのは録画した動画をトラッキングするときだけで、その動画は領域を同じ画面位置に映していなければなりません。

'Open Field and NOR'をクリックしたあと、3Dトラッキングのライセンスを購入し、上からのカメラと側面カメラを同時に使う場合を除き、'2D-tracking mode'と表示されたトグルはそのままにします。3Dを使うには、クリックして'3D-tracking mode'に切り替えます。初回はアクティベーション画面が3Dのコードを求めます。もう一度クリックすると2Dに戻ります。3Dモードではzとxyの両方のしきい値を設定し、トラッキング領域を1つ（1x1）実行できます。

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3Dは、ゾーン解析を含む'Open Field and NOR'モジュールで使えます（水迷路では使えません）。3Dの生データ（タイムスタンプ付きのx、y、z、最大60 Hz）は…\Data\Open Field Test\BOND\の.BONDファイルにあります。Z列がなければ試行は2Dで実行されたので、キャリブレーションと実行の前に3Dに設定します。3Dトラッキングには明るい背景が必要です。カメラが1台しか接続されていなければ、トグルをクリックして'2D-tracking mode'に戻します。解析：'Z-Plot'は時間に対する垂直位置を示します。

解析のゾーンのグリッド線が関心のある境界と合うように、カメラとアリーナを配置します。物体認識では、各物体が1つのグリッドのセルに収まるように設定します。ゾーンのグリッド（解析中に重ねて表示され、ゾーン数の平方根で設定）は、複数アリーナのグリッドとは別物で、別のゾーンの大きさで再解析できます。物体は背景の一部になるので、できれば床と似た色にします。伏せたカップの下に動物を置く社会性テストでは、カップの底を床のような色にし、そのほか対比の強い物体は覆います。訪れない領域やアリーナの間の空間を含め、トラッキング領域全体の背景は、暗い色やフード模様の動物には白、白い動物には黒でなければなりません。

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実行の前にグリッドを計画します。物体をゾーンの中心に置き、配置を一定に保ちます（グリッドに一時的に印を付ける）。体の中心のトラッキングは物体の近くにいた時間を採点し、嗅ぎ行動や前肢での接触は手で採点するか、小さなアリーナでは頭の位置のためにPrecision Trackerを使います。セルに比べて動物が小さい大きなアリーナでは、標準のトラッキングがNORによく合います。物体はMorris Water Mazeモジュールを通じてソフトウェア上でマスクすることもできます（HVSにお問い合わせください）。

'Maze and Field Control Panel'で'Run'をクリックします（求められたらトラッキングのアクティベーションコードを入力）。'Maze Type'タブで'Open Field or Zone Analysis'とアリーナの数（'Single Field'、'2x2 Fields'、'3x3 Fields'）を選んでから、'Tracking'タブを開きます。照明を試行のときとまったく同じにし、物体を置き、各領域に動物を入れて、緑か赤の十字が動物がどこへ行っても追うまで'Set X-Y Threshold'（3Dなら'Set Z Threshold'も）を使います。'Set X-Y Size'は、大きな領域の小さな動物なら左、小さな箱の比較的大きな動物なら右にして、尾ではなく体がトラッキングされ、糞のような小さな跡が無視されるようにします。どのスライダー位置でもうまくいかなければ、色が均一でコントラストがよく、まぶしさや影のないよう照明とカメラの設定を改善し、それから問題のある領域に動物がいるときにスライダーを調整します。

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緑の十字は明るい背景の上の暗い動物を、赤の十字は暗い背景の上の白い動物をトラッキングします。違うほうが出たら、正しい背景色の設定でキャリブレーションし直します。十字が出ない場合は、しきい値と大きさのスライダーのどちらも0になっていないか確認します。大きさを0のすぐ上から始め、しきい値をゆっくり動かして十字が出る位置を探し、それから大きさを体の幅に合わせて微調整します。尾を無視するために動画をぼかす必要はなく、大きさのスライダーを使います。録画した動画では、録画前に条件を整えていなかった場合、明るさとコントラストの調整が必要になることがあります。

3Dではトラッキング領域を1つ（1x1）、2Dでは1つまたは複数（たとえば2x2や3x3）を、単独の試行またはシリーズとして実行できます。'Maze Type'タブでフィールドの数を選び、'Configuration'タブを開いて'Max secs'を入力し、'Single Trial'か'Series of Trials'を選びます。'Run a Trial'タブで、Trial Name（各.hvsファイル名に入り、アリーナが複数ならアリーナ番号が付く）、User Name、Subject、Descriptor（通常は群）、任意のRemarkを入力します。Start Pointは空欄でかまいません。アリーナが複数なら、各被験体のIDを順にパイプ（|）で区切って入力し、記述子も同様にします。テキストファイルに打ち込んで貼り付けるのがいちばん簡単です。'Prepare to Run'をクリックし、被験体を置いて、試行を始めるときに'Run'をクリックします。'End Trial'で早めに止まり、'Return'でメニューに戻ります。

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自動開始は使いません。自動開始は手に反応してしまうことがあるので、動物を放すとき、手がカメラの視野から出た直後に'Run'をクリックします。3x3のようなグリッドは、サブアリーナごとに動物1匹のためのものです。アリーナが1つなら'Single Field'を使います。動物1匹に3x3のグリッドを使うと、.hvsファイルが9つでき、すべてのサブアリーナに被験体と記述子が必要になります。被験体名が試行一覧に対して長すぎる場合は、'Look at HVS'で完全なファイル名を見られます。1つのアリーナに複数の動物を一緒に入れるには別の（多個体）システムが必要なので、HVSにお問い合わせください。

被験体と記述子の一覧を実行順に作り、.txpの拡張子でC:\HVS Image 2027\Users\[username]\Config\Master Experiment Files\に保存します（ここで自動的に開きますが、ほかの場所を参照することもできます）。Excelでは最初の2列を空け、3列目と4列目に被験体と記述子を1試行1行で書きます。アリーナが複数なら、被験体と記述子をパイプで区切ります。例：mouse1|mouse2|mouse3|mouse4とgroupA|groupA|groupB|groupB。[ファイル名].txpで保存し、'All files'が使えなければ種類としてCSVを選びます。メモ帳では各行が,,mouse1,groupAと表示されます。次に'Configuration'タブを開き、'Series of Trials'を選び、'Choose TXP/MEF'をクリックしてファイルを選びます。最初の被験体と群が'Run a Trial'タブに表示されます。

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ソフトウェアが.txpが見つからないと報告する場合、おそらく.txt、.csv、.xlsとして保存されています。'All files'の種類と.txpの拡張子でもう一度保存します。カンマが抜けるとフィールドがずれます（被験体が記述子として表示される）。二重引用符で始まる行は備考です。ビデオフレームを保存するには'Record'にチェックを入れます（専用のアクティベーションが必要）。録画した動画からトラッキングするときはチェックを外します。お使いのバージョンで'Record'が見つからなければ、Supportボタンかお問い合わせページからHVSに連絡します。

'Analyze'をクリックし、Open Field（OFとZA）を選びます。ライブの試行ではVideo HeightとWidthを480と640のままにし、録画した動画では動画の大きさに設定します。試行名をクリックすると経路が見られます。同時に実行したアリーナを一緒に見るには、'Retain Previous Plots'にチェックを入れてそれぞれクリックします。Grid Size（行と列）を入力してEnterを押します。ゾーンの結果は左上から始まり、いちばん左の列を下がってから2列目、という順に続きます。物体や特別な領域が1つのセルかセルのまとまりに入るグリッドの大きさを選びます。すると結果に、それらのセルの時間の割合（%）、経路の割合（%）、進入、潜時が出ます。オープンフィールドではDetection Areaのボタンは無視します。'Analyze Single'は画面上に結果（総経路、所要時間、平均速度、訪れたゾーンの割合、ゾーンへの進入、ゾーンごとの時間の割合、すくみ／不動）を表示します。PrintかExportで、各ゾーンまでの潜時（-1＝未訪問）とゾーンへの進入順を含む完全なテキストファイルが保存されます。

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5x5では、セル5が左下で、セル6が2列目のいちばん上です。内側と外側の合計は、Excelで該当するゾーンの列を足します。3x3の複数アリーナの配置は解析のグリッドとは別です（たとえば、3部屋の箱を分けるには解析のグリッドを3にする）。

すくみとは呼吸以外の完全な不動のことで、不動とは、より長い窓での少ない動きというゆるい基準です。HVS Imageはどちらも時間窓と移動距離で検出します。Freezingの下のTime WindowとMovementの欄で、被験体が何秒間、どの距離の範囲でじっとしていなければならないかを設定します。たとえば、すくみは2 sの間に0.1 cmを超えて動かないこと、不動は10 sの間に5 cmを超えて動かないことです。どちらも関係なければ、大きなTime Window（例：100 s）と小さなMovement（0.1 cm）を設定し、結果にすくみを含めないでください。結果には、すくみのエピソード数、すくんだ時間、すくんだ時間の割合（%）が含まれます。

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ソフトウェアは実際のすくみの総時間、時間の割合（%）、エピソード数を報告します。10秒ごとの固定のタイムサンプリングの設定はありません。側面から見る恐怖条件づけのチャンバーでは、前方の高い位置にカメラ1台を付けた2Dを使い、チャンバー内の明るい部分は黒で覆い、格子が反射しないよう照明を調整します。頭に暗い点を付けると、すくみのトラッキングに役立つことがあります。

試行を選び、'Setup Custom'をクリックします。CSTファイル名を入力し、上の部分と'Open Field and Zone Analysis Variables'で欲しい項目にチェックを入れ（'Maze Variables'は無視）、'Save Spec'をクリックします。解析画面の右上のパネルでそのCSTファイルを選び、試行を選んで（Ctrlクリック、またはShiftと矢印キー）'Auto-Analyze'をクリックします。軌跡が次々に表示されることがあります。'View CST'をクリックする（またはCSTの名前をダブルクリックする）と表示されます。CSTファイルはカンマ区切りで、C:\HVS Image 2027\Users\[username]\Data\Open Field Test\CSTにあります。Excelでは各試行が1行、項目ごとに1列で、ゾーンごとの時間の割合（%）は標準の順でセルごとに1列です。

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Excelへの読み込み：Data > From Text/CSV、All Filesを選び、.cstを選んで、区切り記号Comma、Load（古いExcel：Data > Get External Data > From Text、区切り記号付き、カンマ）。同じ試行について、グリッドの大きさや項目を変えたCSTファイルをいくつも作れます。複数アリーナのグリッドのセルは、左上が最初、右下が最後に並びます（3x3では9番目）。エクスポートしたファイルの経路の座標は、Excelやほかのグラフソフトで描けます。

'Record'にチェックを入れると、各フレームがC:\HVS Image 2027\Users\[username]\Data\[experiment type]\Videos\に保存されます。代表的なオープンソースの変換ツールであるFFmpegが、専用の説明書とともにC:\HVS Image 2027\Helper Apps\ffmpeg\に付属しています。動画ではなくフレームを保存すると、次の試行のトラッキング中に圧縮が動かず、すべてのフレームが元の解像度で残り、圧縮とフレームレートを自分で選べます。

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ビデオフレーム記録には、トラッキングや解析とは別のアクティベーションコードが必要です。フレームレートのスライダーは0（記録なし）からフレーム間隔1000 msまでで、100 msで約10フレーム／sです。非常に短い間隔では、PCの速さによってフレームが少なくなることがあります（最大でおよそ0.03 sに1フレーム）。フレームはディスク容量を多く使うので、古いVideosフォルダーはPCの外に移します。HVS Imageはディスクの空きが10%を切ると警告します。

マウスのプロトコル：50 × 50 × 38 cm、500-1000 lux、少なくとも30 minの馴化、10 minのテスト、95%エタノールで清掃[Seibenhener & Wooten 2015]。中央滞在時間と壁沿い行動は不安を反映します[Prut & Belzung 2003]。

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光の強さはオープンフィールドの不安の指標に強く影響するので、一定に保ちます。